Трудности и перспективы создания вакцины от СПИДа

К тяжелейшим последствиям СПИДа относится распространение этого заболевания в странах развивающегося мира. СПИД принес беспрецедентные страдания, инвалидность и смерть миллионам людей, нарушил семейную, социальную и экономическую стабильность. В связи с высокой стоимостью медикаментозного лечения СПИДа и большими организационными трудностями, медико-биологическое сообщество пытается решить проблему создания вакцины против ВИЧ инфекции.

Поиски вакцины от СПИДа начались более 15 лет назад в атмосфере огромного оптимизма и больших ожиданий. Когда было установлено, что причиной СПИДа является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), казалось, что создание вакцины - дело ближайшего будущего. Однако проблема оказалась более сложной, и, несмотря на огромные усилия, прогресс на этом пути не соответствовал ожиданиям. В настоящей статье рассматриваются главные препятствия, лежащие в сфере научных исследований, к созданию эффективной вакцины против ВИЧ; далее рассматриваются возможные стратегии для преодоления этих препятствий.

Проблема
[ Содержание]

Поучительно рассмотреть обстоятельства успешной разработки вакцин в прошлом. Создание вакцины против оспы - одно из наиболее ярких достижений в истории медицины. Почему 200 лет назад, в отсутствие современной биотехнологии создание вакцины против оспы так быстро увенчалось успехом, в то время как создание вакцины против СПИДа остается нерешенной задачей? Ответ заключается в том, что сама природа дала проницательному наблюдателю четкие указания. Эдвард Дженнер обратил внимание на то, что молочницы, ранее переболевшие коровьей оспой, не заболевали обычной оспой. Это наблюдение позволило установить факт перекрестной иммунологической реакции двух вирусов, позволяющий использовать вирус коровьей оспы для защиты от обычной.

Молочницы Дженнера представляли собой "защищенную группу", и это было ключевой информацией, необходимой для создания вакцины. К сожалению, в случае ВИЧ инфекции значительных по численности групп с четкой резистентностью не существует, и, таким образом, неизвестны параметры иммунитета, коррелирующие с защитой от инфекции. В Найроби была выявлена группа экспонированных ВИЧ, но серонегативных секс-работниц (1), высказывались надежды, что эта группа может дать ценную информацию об иммунной устойчивости к вирусу. К сожалению, защита не всегда была длительной, и механизм устойчивости не был четко определенным; поэтому так и не удалось получить информацию о критически важных маркерах, которые могли бы стать ориентиром при разработке вакцины.

Разработка вакцины против ВИЧ возможна и без наличия коррелятов иммунитета или искусственного (суррогатного) маркера защиты, однако при этом путь к созданию вакцины будет значительно более трудным. Отсутствие иммунных коррелятов остается одной из наиболее серьезных проблем для разработки вакцины от СПИДа (Таблица 1). Еще одним критическим барьером является выявление иммуногенов, которые вызывают длительный иммунитет с широким спектром. Еще одна трудность связана с генетической изменчивостью (разнообразием) вируса: ВИЧ обладает необычно высокой изменчивостью, которая осложняет создание вакцины, универсально эффективной в отношении различных субтипов и штаммов вируса (2). Отметим, что в отличие от ВИЧ, межштаммовые вариации других вирусов, таких как вирус полиомиелита, для которого была успешно создана вакцина, являются относительно небольшими. Так, во всем мире успешно используется вакцина против полиомиелита на основе всего трех штаммов вируса (3, 4).

Прогресс в области создания вакцины против ВИЧ также осложняется трудностями, связанными с использованием экспериментальных животных. Инфекция, вызываемая лентивирусами у низших (негуманоидных) приматов, является хорошей моделью для разработки вакцины против вируса и дала важные данные в отношении иммунопатогенеза ВИЧ. Однако, несмотря на значительное сходство в симптоматике и патологии, имеются различия, которые могут повлиять на эффективность вакцины. Например, вирусы иммунодефицита обезьян (ВИО) существенно отличаются от соответствующих вирусов человека. В плане организации генома вирусный дополнительный белок Vpx ВИО отсутствует в геноме ВИЧ-1, генный продукт Vpu, присутствующий в ВИЧ-1,отсутствует в геноме ВИО (см. обзор в ссылке 5), и функции белка Vpr также отличаются у этих вирусов. Хотя некоторые штаммы ВИЧ вызывают заболевание у шимпанзе, этот вид в значительной степени устойчив к CCR5-тропным первичным изолятам, ответственным за большинство случаев инфекции у человека (6), что указывает на видоспецифические различия в ответе организма на вирус. Характеристики молекулярных клонов и вирусов, адаптированных в лаборатории, также отличаются от характеристик вируса, вызывающих инфекцию в естественных условиях. Несмотря на привлекательные характеристики обезьяньей модели, очевидно, что для разработки эффективных вакцин потребуются клинические исследования на человеке. Такие испытания требуют производства вакцин клинического уровня качества и соответствующих исследований по безопасности и токсичности, а это создает дополнительные проблемы. В ходе испытаний наиболее важная задача будет заключаться в определении выбора перспективных кандидатов для клинических испытаний по фазе III. В таких испытаниях тестируется эффективность вакцины, полученной на основании ограниченной информации.

Иммунный ответ на вакцины против ВИЧ
[ Содержание]

Иммунная система реагирует на инфекционные агенты путем формирования гуморального ответа, при котором В-лимфоциты образуют растворимые антитела, взаимодействующие с инфекционными агентами (бактерии, вирусы, грибки и паразиты). Клеточный иммунный ответ индуцирует хелперные Т-лимфоциты, которые стимулируют образование антител, и цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), которые узнают презентированные антигены и лизируют инфицированные клетки. Оба этих иммунных механизма можно использовать при разработке вакцины, и каждый из них обладает своими преимуществами и недостатками (Таблица 2).

Клеточный иммунитет
[ Содержание]

ЦТЛ известны также под названием киллерных Т-клеток, поскольку они узнают, связывают и убивают клетки, содержащие чужеродные антигены. Их роль в защитном иммунитете против вирусных инфекций хорошо известна (7, 8). Иммуноген, вызывающий ответ через образование ЦТЛ, позволяет распознавать и устранять из организма инфицированные клетки, и такой ЦТЛ ответ является крайне желательным в случае вакцины против СПИДа, потому что ЦТЛ могут устранять вирус или снижать его образование в организме, убивая клетки, продуцирующие вирус. О важности ЦТЛ ответа в ограничении вирусной инфекции свидетельствуют результаты исследований, выполненных на человеке, а также на низших (негуманоидных) приматах (1, 9, 10). Мощный ЦТЛ ответ и резистентность к ВИЧ были обнаружены у экспонированных вирусу серонегативных секс-работников в Найроби, о которых шла речь выше (1). В экспериментах с макаками резус, хронически инфицированными ВИО, наблюдалось заметное увеличение вирусной нагрузки, когда у этих животных в эксперименте искусственно снижали содержание CD8+ Т-лимфоцитов (8, 10).

Несмотря на важность ЦТЛ в ограничении репликации вируса, неясно, будет ли клеточный иммунитет необходимым и достаточным для создания высокоэффективной вакцины. Остается неясным, будет ли возможно поддерживать популяцию ЦТЛ в активном состоянии в течение длительных промежутков времени и можно ли будет быстро усилить ЦТЛ ответ в условиях острой вирусной инфекции. Далее, вакцины, строго зависящие от ЦТЛ ответа, могут становиться неэффективными в результате адаптаций вируса, позволяющих ему ускользать от обнаружения Т-клетками. Например, ВИЧ имеет механизмы, нарушающие функционирование белков основного комплекса гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex=MHC), т.е. белков, презентирующих антигены, с которыми взаимодействуют Т-клетки для узнавания чужеродных антигенов на клеточной поверхности. В одном из этих механизмов используется генный продукт ВИЧ под названием Nef. Он понижает экспрессию CD4 и MHC класса I, т.е. тех белков клеточной поверхности, которые важны для узнавания вирусных антигенов на клетках, продуцирующих вирус, в рамках ЦТЛ ответа (11-13).

Гуморальный иммунитет
[ Содержание]

Поскольку маловероятно, что ответ ЦТЛ сам по себе будет обеспечивать полную защиту, важно, чтобы вакцина против ВИЧ также индуцировала антитела, нейтрализующие вирус. Образование таких антител зависит от В-лимфоцитов памяти, т.е. от долгоживущей клеточной популяции, которая может делиться и дифференцироваться с образованием (при повторной экспозиции антигену) продуцирующих антитела плазмацитов, что обеспечивает длительную защиту. Еще одно преимущество действия антител заключается в том, что они обладают способностью инактивировать вирус до того, как у него появился шанс инфицировать клетки хозяина. Антитела могут также мобилизовать систему воспаления, включая систему комплемента, нейтрофилы и моноциты. Таким образом, даже когда антитела не нейтрализуют вирус непосредственно, существует возможность того, что другие эффекторные функции антител будут усилены за счет использования системы воспаления.

Образование антител должно быть критически важным этапом при формировании антивирусного иммунитета. Однако, одним из главных препятствий для создания высокоэффективной вакцины против ВИЧ является трудность получения иммуногенов, вызывающих широкий спектр нейтрализующих антител. Оказалось возможным получить антитела против белка оболочки ВИЧ, однако они обладают ограниченной эффективностью. Эта проблема возникает отчасти и потому, что такие антитела нейтрализуют адаптированные к лабораторным условиям штаммы вируса, но неэффективны в отношении первичных изолятов. Кроме того, часто они являются штаммоспецифическими (14). Хотя было получено несколько обладающих широким нейтрализующим действием моноклональных антител, нейтрализующих инфекционность различных штаммов вируса, оказалось невозможным вызвать такой ответ иммуногенами с четко заданными свойствами (см. обзор в ссылках 15-18). Большое генетическое разнообразие различных штаммов и подтипов ВИЧ создает значительные трудности в этом отношении. Кроме того, высказывались мнения о том, что некоторые антитела могут повышать инфекционность (19-21), и, действительно, прецеденты такого рода осложнений в области разработки вакцин имеются. При попытках создания вакцин против вируса респираторного синцития некоторые из ранних кандидатов на вакцину вызывали обострение инфекции (22, 23). Ясно, что ответ организма в плане образования антител должен быть подвергнут тщательной оценке.

Для разработки эффективной вакцины от СПИДа также важна способность антител обеспечивать защиту на уровне слизистой. В нескольких работах исследовалась способность антител защищать от инфекции после внутривенного введения вируса (14), а также от заражения через слизистые, причем результаты оказались обнадеживающими. С использованием гибридных (химерных) вирусов ВИО/ВИЧ у низших (негуманоидных) приматов Mascola и соавт. проводили вливание нейтрализующих антител макакам-резус с целью защиты от вагинального инфицирования (24), а Baba и соавт. исследовали действие таких антител при пероральной экспозиции слизистой вирусу после рождения (25). По данным обоих исследований, пассивное введение антител обеспечивало защиту от заболевания. Хотя использовались относительно высокие концентрации антител (100 мкг/мл и более) - такие концентрации являются значительно более высокими, чем те, которые обычно достигаются при вакцинации - эти исследования показали, что соответствующий ответ в плане присутствия антител в сыворотке может уменьшать инфицирование через слизистые. Маловероятно, что такие высокие концентрации антител могут достигаться при вакцинации. Правда, вакцины могут также создавать клеточный иммунитет, что приведет к снижению требуемой для защиты от инфекции концентрации нейтрализующих антител. Также высказываются надежды, что синергизм между нейтрализующими антителами в отношении различных детерминант может снизить концентрацию, требуемую для эффективной нейтрализации вируса.

Вирусные вакцины, дефектные по репликации
[ Содержание]

Наилучшим примером защиты от инфекций лентивирусом (различные виды ВИЧ относятся к ретровирусам из рода лентивирусов) включают использование живого аттенуированного вируса. Desrosiers и соавт. показали, что обезьяны, инфицированные ВИО, аттенуированного за счет делеции вирусного гена nef, не инфицировались при последующей экспозиции ВИО дикого типа или ВИО с делецией nef (26). Однако, несмотря на первоначальный энтузиазм, вызванный этими, казалось бы, обнадеживающими результатами, дополнительные наблюдения продемонстрировали потенциальный риск такого подхода. В конце концов, было обнаружено, что как у новорожденных, так и у взрослых макак после экспозиции аттенуированному ВИО наблюдались выраженные патологические явления (27-29). Кроме того, опубликовано несколько сообщений о больных, инфицированных ВИЧ, который содержал естественные мутации в nef или в регуляторном районе длинного концевого повтора. Исходно у этих больных наблюдалась менее активная прогрессия заболевания, однако с течением времени у них снижалось содержание CD4 лимфоцитов и увеличивалась вирусная нагрузка (30-32). Хотя живые аттенуированные вирусы могут в конечном счете оказаться эффективными и безопасными, необходимо снять многочисленные остающиеся вопросы прежде, чем они станут пригодными для использования в клинических испытаниях на человеке.

Для эффективной вакцины необходим мультикомпонентный иммунитет
[ Содержание]

В отсутствие известных иммунных коррелятов защиты от ВИЧ разумнее всего была бы разработка вакцины, стимулирующей многие компоненты иммунной системы (33). Логический вывод обширной литературы по иммунной защите при инфекции лентивирусами заключается в том, что для создания высокоэффективной вакцины от ВИЧ необходима комбинация долгоживущих Т-лимфоцитов памяти, таких как CD8+, ЦТЛ и CD4+ хелперных Т-клеток памяти. В то же время для создания высокоэффективного длительного иммунитета необходима стратегия индукции широкого спектра нейтрализующих антител. В настоящее время очевидно, что для инфекции ВИЧ необходимы рецепторы бета-хемокина (см. обзор ссылок 34-35). По существу, одним из наиболее убедительных примеров естественного иммунитета к ВИЧ являются лица с мутациями данного рецептора (36, 37). Иммуногены, вызывающие образование антител, которые нарушают связывание с рецептором бета-хемокина, могут оказаться ценными в этом отношении.

Итак, хотя иммунологические корреляты защиты от ВИЧ остаются неизвестными, имеются данные о том, что клеточный иммунитет также ограничивает репликацию вируса. В то же самое время, примеры других успешных случаев создания вакцины показали, что длительная иммунологическая память, связанная с В-лимфоцитами, является критически важной для иммунной защиты. Одна часть задачи заключается в создании вакцины, которая сможет вызвать длительный ответ Т-лимфоцитов с широким спектром, другая часть задачи заключается в нахождении антигенов, которые будут вызывать "корректный" (также в плане широкого спектра) ответ в виде образования антител.

Вакцины на основе рекомбинантных векторов и адъюванты
[ Содержание]

Исследовался ряд стратегий создания вакцины на основе использования инактивированных вирусов или индивидуальных вирусных компонентов (38). Исходными иммуногенами, по-прежнему наиболее часто применяемыми в вакцинах, являются живые аттенуированные или инактивированные вирусы. Аттенуированные вирусы оказались безопасными и эффективными для создания многих широко используемых вакцин, включая вакцину от полиомиелита Сэбина и вакцину от оспы кур. В этих случаях непатогенный аттенуированный вирус вызывает иммунный ответ организма, обеспечивающий иммунологическую перекрестную реакцию с вирулентным вирусом. Недавно для доставки отдельных вирусных иммуногенов, которые могут индуцировать защитный иммунитет, использовались дефектные по репликации вирусные векторы, не имеющие отношения к возбудителю. Еще один новый подход был связан с использованием полученной с помощью генной инженерии плазмидной ДНК, направляющей синтез иммуногена в клетках организма хозяина (см. обзоры в ссылках 39 и 40). Сочетание этих подходов, в частности применение на первой стадии иммунизации вакцины на основе ДНК с последующей доиммунизацией вирусным вектором, особенно перспективно с точки зрения данных, полученных при разработке вакцины на животных моделях.

Невирусные векторы
[ Содержание]

ДНК вакцины содержат ген, кодирующий иммуноген вируса, этот ген снабжен регулирующим эукариотическим энхансером-промотером и сигналом полиаденилирования, которые обеспечивают нужную экспрессию вирусного иммуногена. Различные компоненты ДНК вакцин можно легко настраивать для оптимизации уровня, продолжительности экспрессии и силы действия иммуногена. При инъекции в мышцу клетки, окружающие место инъекции, захватывают плазмиду, а ДНК транспортируется в ядро, где происходит ее транскрипция; далее следуют этапы трансляции и соответствующих посттрансляционных модификаций. По сравнению с рекомбинантными белковыми вакцинами, полученными в клетках бактерий или дрожжей, белки, экспрессированные с использованием ДНК-вакцины, с большей вероятностью приобретают нативную конформацию, а их локальное образование способствует захвату этих белков клетками, презентирующими антиген. Антитела, образовавшиеся в ответ на введение таких иммуногенов, с большей вероятностью будут узнавать нативные неденатурированные белки возбудителя и обеспечивать защиту от них. Кроме того, синтез антигенов в клетках приведет к более эффективному процессингу MHC класса I и презентации антигенов, которая будет стимулировать ЦТЛ ответ.

Использование ДНК-вакцин может снять некоторые потенциальные недостатки вакцин, изготовленных на основе живого аттенуированного вируса. К таким недостаткам относится возможность патогенной инфекции и наличие побочных эффектов, связанных с хронической иммуностимуляцией. Возможность генетической иммунизации была продемонстрирована в нескольких экспериментальных модельных системах (41-43). У грызунов такая иммунизация оказалась эффективной в плане индукции иммунитета к ряду инфекционных заболеваний, включая заболевания, вызываемые вирусом гриппа (44), малярию (45-48), туберкулез (49), инфекцию вирусом Эбола (50), бешенство (51), инфекцию вирусом лимфоцитарного хориоменингита (52, 53) и инфекцию вирусом простого герпеса (54). Исследования на низших (негуманоидных) приматах, а также на человеке показали, что такой подход является особенно эффективным в плане индукции ЦТЛ ответа (55). Недавнее исследование продемонстрировало, что макаки-резус, получавшие вакцину на основе ДНК в комбинации с рекомбинантной плазмидой, кодирующей интерлейкин-2, давали мощный ЦТЛ ответ и не обнаруживали признаков клинического заболевания после введения патогенного гибридного/рекомбинантного ВИЧ/ВИО (56). Это важно не только в плане демонстрации успеха использования ДНК-вакцин ДНК, но также и потому, что проведенная вакцинация предотвращала появление симптомов заболевания.

Несмотря на перспективные результаты у грызунов, вакцинация ДНК оказалась менее эффективной у приматов. Вероятно, это различие является техническим и его удастся преодолеть в будущем с большим опытом. Для улучшения таких вакцин используется несколько подходов. Например, существует стратегия, основанная на использовании более мощной экспрессии гена, когда применяются более сильные энхансеры или проводится амплификация гена. Другой подход заключается в модификации транскрипционной и трансляционной эффективности чужеродной ДНК за счет использования кодонов, предпочтительно используемых в организме хозяина (57, 58). Использование кодонов человека в некоторых векторах, особенно из вирусов и других инфекционных агентов, значительно повышает уровень синтеза конечного продукта, вероятнее всего, за счет модификации РНК-регуляторных структур, которые подавляют экспорт из ядра в цитоплазму и таким образом не допускают эффективной транскрипции и трансляции на полную длину. В результате преодоления этих препятствий для экспрессии, количество антигена, презентируемого иммунной системе, повышается, а это может оказаться полезным в плане индукции более эффективного анти-ВИЧ иммунитета.

Вирусные векторы
[ Содержание]

Усилия по созданию вирусных вакцин и генотерапии привели к созданию на протяжении последних лет новых вирусных векторов. Такие векторы могут оказаться полезными для создания вакцин от СПИДа. Они включают дефектные по репликации формы вируса группы оспы, включая вирус оспы канареек, вирус оспы птиц и модифицированный вирус вакцины Анкара (59-61). Также могут оказаться полезными высокоиммуногенные вирусы, например, аденовирус, особенно когда используются штаммы, не реагирующие с антителами, обычно встречающимися у человека. Другие векторы прошли стадию доклинической разработки, они включают вирусы Синдбис (62, 63) и альфавирусы вируса Венесуэльского энцефалита лошадей (64, 65). Дефектные по репликации векторы, полученные на основе этих вирусов, обеспечивают синтез высоких количеств рекомбинантного белка, и его доставка может направляться в дендритные клетки. Кроме того, были идентифицированы векторы, которые обеспечивают персистирующую длительную экспрессию трансгенов с целью получения непрерывной стимуляции и активации Т-лимфоцитов. Успехи в создании вектора на основе лентивирусов продемонстрировали, что лентивирусы можно успешно модифицировать и, следовательно, решить ряд вопросов, связанных с проблемами безопасности (66-68). Для достижения длительной экспрессии гена также оказался эффективным один из вирусов группы аденовирусов, он является предметом исследования при создании вакцин от СПИДа (69,70).

Адъюванты
[ Содержание]

Ключом к созданию успешной вакцины является использование адъювантов, которые усиливают иммунный ответ на специфические антигены. Адъювантами традиционно назывались вещества, используемые в комбинации со специфическим антигеном, чтобы вызывать более сильный иммунный ответ по сравнению с тем, который такой антиген вызывает индивидуально (без адъюванта). На моделях экспериментальных животных и в исследованиях на человеке исследовался целый ряд адъювантов, этот предмет является темой интенсивных исследований, в отношении которых написан ряд интересных статей и обзоров (71-75). Что касается вакцин против ВИЧ, то ряд адъювантов был подвергнут испытанию в рамках клинических исследований по Фазе I. Такие адъюванты включают полимеры, такие как олиголизин, липопептиды и сополимеры на основе полилактида (76). Исследовались традиционные адъюванты, такие как фосфат алюминия или гидроокись алюминия, преципитируемый совместно с антигеном, QS-21, MF59, монофосфорил липид А, минеральное масло, маннозомоноолеат, неполный адъюванта Фрейнда, очищенное белковое производное (Purified Protein Derivative=PPD) , гемоцианин пиявки и бупивикаин (для ДНК-вакцин) - степень их эффективности была разной (см. сводку в ссылке 76). Кроме того, был использован ряд новаторcких технологий, включая использование цитокинов или векторов, экспрессирующих ДНК-цитокинов, применение иммуностимулирующих ДНК-последовательностей и получение новых комплексов для создания микрочастиц, которые могут способствовать захвату клеток, презентирующих антиген.

Механизмы действия этих адъювантов остаются не вполне понятными, имеющиеся гипотезы включают следующее: (1) избирательную стимуляцию специфических наборов Т-лимфоцитов; (2) доставку антигена антиген-презентирующим клеткам; (3) направление антигена на путь MHC класса I или МНС класса II; (4) образование депонированной формы антигена с последующим медленным его высвобождением; (5) стабилизацию эпитопов. Эффективность адъювантов может зависеть от целого ряда факторов. Эти переменные связаны со способом введения и составом адъюванта, видоспецифическим ответом на иммуностимулирующее действие адъюванта и иммунным статусом организма хозяина. До настоящего времени не существует какого-либо явно предпочтительного адъюванта для использования в вакцинах против ВИЧ. Этот вопрос уже был предметом серьезных исследований по Фазе I, проводимых группой по испытаниям вакцин (Vaccine Trials Network), работающей при поддержке Национального института здоровья США; вероятно, эти вопросы будут продолжать оставаться предметом важных исследований, связанных с разработкой высокоэффективных вакцин.

Выбор иммуногенов
[ Содержание]

Геном ВИЧ кодирует более 12 генных продуктов, любой из которых может быть использован в качестве мишени для узнавания иммунной системой. Синтез этих вирусных белков регулируется вирусными трансактиваторами, включая белки, образующиеся на информационной РНК, синтезированной на вирусной РНК после ее глубокого сплайсинга, что происходит на ранних стадиях инфекции. Другие белки синтезируются на информационных РНК, образующихся из не подвергнутых сплайсингу вирусных РНК, синтезированных на поздних стадиях жизненного цикла вируса в клетке. Некоторые из этих вирусных белков важны для структуры вируса и синтезируются в больших количествах: это белки матрикса и капсида. Другие информационные РНК кодируют синтез регуляторных белков, модулирующих экспрессию генов вируса - эти белки синтезируются в меньших количествах. Поскольку ЦТЛ, вероятно, будет более эффективен по сравнению с антителами против внутренних белков вируса, целый ряд исследований был сосредоточен на использовании белков Gag в качестве иммуногенов для индукции ЦТЛ ответа. Что же касается белка Env, который находится на поверхности вируса (несмотря на то, что ЦТЛ ответ, вероятно, приведет к положительным результатам), экспонированность этого белка на целых неповрежденных вирусных частицах делает его хорошей мишенью для нейтрализующих антител. Эти два продукта, синтезирующиеся на поздних, не прошедших сплайсинг вирусных РНК, по общему мнению, являются важными компонентами для создания высокоэффективной вакцины против ВИЧ.

Среди ранних вирусных РНК продуктов, образовавшихся в результате глубокого сплайсинга, с высокой интенсивностью происходит экспрессия иРНК для Nef. Более того, была показана важность этого белка для репликации вируса (77), хотя неясно, может ли он представлять собой эффективную мишень при создании вакцины. Поскольку этот белок экспрессируется на ранних стадиях жизненного цикла вируса, иммунный ответ на него может ограничивать выход вируса из индивидуальной клетки, что может давать вклад в создание защитного иммунитета. Наконец, регуляторные белки Tat и Rev оказываются в центре внимания из-за их мощных регулирующих свойств. Белок Rev находится главным образом в ядре, однако не экспрессируется в высоких концентрациях. Поскольку не он является высокоиммуногенным, его не считают перспективным кандидатом для создания вакцины. Напротив, белок Tat, хотя он также обнаруживается в ядре в низких концентрациях, описан и во внеклеточных тканях, и некоторые исследователи предположили, что он может обладать биологическими эффектами, имеющими отношение к патогенезу ВИЧ заболевания (см. обзор в работе 78). В нескольких лабораториях исследовалась потенциальная возможность использования белка Tat в качестве компонента для создания вакцины от СПИДа. Хотя опубликованные сообщения показали, что модифицированные формы белков Tat могут индуцировать иммунный ответ, приводящий к снижению репликации вируса у экспериментальных животных, включая низших (негуманоидных) приматов (79, 80), пока неясно, как соотносятся такие модели с естественной инфекцией у человека (81). Кроме того, защитные эффекты при иммунизации модифицированными белками Tat, не наблюдались, когда доставка Tat в организм осуществлялась путем введения его гена. Эти данные поставили под сомнение эффективность применения Tat в качестве иммуногена. Неясно, связано ли это различие с альтернативными иммунными ответами на Tat при введении самого белка по сравнению с введением гена, или же оно обусловлено специфическими характеристиками модели инфекции на низших приматах или какими-то другими пока неизвестными переменными; в этом направлении требуются дальнейшие исследования.

Ускользание ВИЧ от иммунной системы
[ Содержание]

Трудности создания вакцины против ВИЧ идут дальше, чем вопросы оптимизации экспрессии. Получение антител как таковых не представляет собой проблемы. Трудность заключается в нахождении иммуногенов, которые стимулируют образование широкого набора нейтрализующих антител. Существует целый ряд причин, почему эту проблему так трудно решить. К ним относятся многочисленные адаптации, которые ВИЧ выработал в ходе эволюции, чтобы противодействовать иммунной системе организме.

Почти каждое зараженное лицо дает на ВИЧ иммунный ответ - поэтому ВИЧ является вирусом, который в ходе эволюции подвергался отбору в присутствии антител. Компонентом вируса, наиболее доступным для действия иммунной системы, является его оболочка. Следовательно, именно белки оболочки эволюировали в условиях давления отбора с тем, чтобы избежать распознавания иммунной системой (см. обзор в ссылке 82). Ускользнуть от распознавания иммунной системой можно несколькими способами, например, путем гликозилирования белков оболочки и маскирования критически важных участков белков, включая участки связывания с CD4 и корецепторами. Кроме того, сама оболочка является конформационно активной (82). Так, некоторые структуры, которые должны участвовать в узнавании в тот момент, когда вирус взаимодействует с рецептором, не экспонируются, когда они могут быть доступными для В-лимфоцитов или антител. Кроме того, возможно, что оболочка вируса создала имитационные механизмы защиты. Например, белок оболочки включает эпитопы, которые могут вызывать иммунный ответ, отвлекающий узнавание от высоко консервативных районов белка оболочки, критически важных для связывания с рецепторами и вхождения в клетку. ВИЧ может ускользать от обнаружения системой клеточного иммунного ответа за счет многочисленных механизмов, например, за счет вызываемого белком Nef снижения экспрессии MHC класса I или же счет сложных механизмов генной регуляции, обеспечивающих латентное инфицирование клеток.

Соотношения между структурой и функцией при создании иммуногена
[ Содержание]

Безусловно, достижение успеха в создании вакцины требует более детального понимания структуры оболочки вируса. Рентгеноструктурные и кристаллографические исследования (83-86) дали ценную информацию о структуре белков оболочки gp120 и gp41. Структура кристаллов gp120, например, демонстрирует многочисленные механизмы ускользания от иммунного ответа, включая конформационные изменения, сферическую недоступность, островки вариаций и углеводный защитный чехол (82). Анализ gp120 в комплексе с CD4, основным рецептором вируса, например, показывает, что участок связывания CD4 является заглубленным и содержит несколько "впадин". Многие остатки, критически важные для узнавания антителами против этого района, недоступны в конформациях, образующихся после связывания gp120 с CD4, хотя ободок консервативной "впадины Phe43" может быть доступным для нейтрализующих антител (82). Вероятно, нативный белок оболочки необходимо изменить, чтобы он служил эффективным иммуногеном и презентировал эпитопы, которые могут вызвать образование нейтрализующих антител. Другие потенциальные молекулярные мишени включают структуры, которые могут экспонироваться транзиторно во время слияния вируса с клеткой и его вхождения в клетку. Одна из возможностей заключается в том, чтобы попытаться получить антитело, которое индуцирует конформационное изменение на шипике оболочки вируса, в результате чего произойдет экспонирование участков, скрытых в обычном состоянии (например, обычно скрытых поверхностей на gp120, связывающихся с рецептором хемокина). Далее такие участки могут быть атакованы с помощью второго антитела.

Белок вирусной оболочки обладает иммуногенностью и после инъекции реципиенту дает определенный стандартный иммунный ответ. Различные компоненты вируса дают различный ответ. Например, если мышам инъецировать ДНК, кодирующую gp160, легко формируется ЦТЛ ответ. Однако, если проанализировать образование антител у этих же мышей, то оказывается, что титры являются очень низкими. В то же время другой вирусный ген - nef - индуцирует антитела с высоким титром, но ЦТЛ ответ является низким. Важно попытаться выяснить генетические и структурные основы различных иммунных ответов, например, через анализ иммуногенности различных мутантов белка оболочки вируса. Конечная цель заключается в том, чтобы использовать информацию об иммуногенности совместно с анализом физической структуры мутантных белков. Хотя иммуногенность может зависеть от вектора и/или адъюванта, понимание структуры в связи с иммуногенностью может помочь найти перспективные кандидаты для получения вакцины.

Еще один структурный подход к созданию вакцины возник в ходе рассмотрения механизма слияния вируса с клеткой и анализа той части белка gp41 ВИЧ, который содержит структуры, участвующие в этом процессе. Слияние требует образования двух тройных спиральных участков клубок-клубок, которые сворачиваются в шпильку, образуя шестиспиральный пучок (85, 86). Спиральная структура клубок-клубок способствует инсерции пептидов слияния в клетку-мишень. Эта структура не является уникальной для ВИЧ, поскольку она обнаруживается у целого ряда вирусов, включая вирус гриппа, вирус лейкоза мышей, ВИО и вирус респираторного синцития; эта структура также существует в эукариотических клетках в растворимом рецепторе присоединения NSF (SNARE), участвующем в слиянии везикул (см. сводку в ссылке 87).

Matthews, Hunter и Bolognesi (88), а также Kim и соавт. (89) показали, что пептид, препятствующий образованию спиральной структуры клубок-клубок в gp41 ВИЧ, нарушает слияние вируса с клеткой и снижает значения вирусной нагрузки в клинических исследованиях на человеке. В результате внимание было сфокусировано на этой структуре, как на возможной мишени для нейтрализации антителами, однако, к сожалению, полученные антитела к этой структуре не нейтрализовали вирус. Вероятно, уже образовавшаяся шестиспиральная структура клубок-клубок недоступна для антител. Другой подход заключался в том, чтобы использовать в качестве мишени промежуточные структуры, образующиеся еще до формирования шпильки. Nunberg и соавт. использовали этот подход в экспериментах, где мышей иммунизировали комплексом клеток, экспрессирующих Env, в сочетании с клетками мишенями CD4+/CCR5+ в попытках сформировать промежуточные продукты слияния (90). Хотя данные, полученные в указанном исследовании, были многообещающими, такой метод трудно использовать на моделях приматов, и он также будет трудным для крупномасштабного производства вакцины. Тем не менее, во многих лабораториях продолжаются исследования по иммунизации промежуточными продуктами слияния с использованием альтернативных молекулярных подходов. Пока неизвестно, будут ли идентифицированы такие промежуточные продукты с белками оболочки вируса, однако, комбинируя технологии ДНК и структурную информацию, можно быстро создать и проверить ряд иммуногенов, которые могут оказаться полезными для разработки вакцины.

Существующие и будущие направления в области создания вакцины от СПИДа
[ Содержание]

Проблемы разработки вакцины против СПИДа сходны с проблемами, оставшимися нерешенными для ряда других, важных в медицинском отношении инфекционных заболеваний, включая малярию и туберкулез. Во всех этих случаях необходимы безопасные и эффективные вакцины широкого спектра действия, продуцирующие длительную иммунную память и защиту в точке инфекции, особенно на уровне слизистой, где возбудитель попадает в организм. Поскольку вакцины нужны в тех регионах мира, где не всегда имеется современная медицинская помощь, также необходимо иметь простые транспортируемые векторы, которые можно легко использовать.

Вакцины против ВИЧ до настоящего времени подвергались испытанию более чем в 70 исследованиях по Фазе I (безопасность и токсичность при наращивании дозы), в пяти исследованиях по Фазе II (расширенное исследование по безопасности и оптимизации дозы) и в двух клинических исследованиях по Фазе III (исследование эффективности). В этих исследованиях была оценена безопасность и иммуногенность профилактических вакцин более чем на 3500 испытуемых. Среди проверявшихся вакцин несколько было основано на использовании белков оболочки, полученных в клетках насекомых, дрожжей или млекопитающих с использованием технологии рекомбинантной ДНК и генов, кодирующих белки gp120 и gp160, причем они применялись с различными адъювантами. Пептиды, являющиеся производными петли V3 белка оболочки Gag, доставлялись в организм в виде конъюгатов с олиголизиновым скелетом, в виде конъюгатов с липопептидами, с солями алюминия или же в форме белков слияния с дрожжевым белком Ty, который образует частицу за счет самосборки. Анализировались альтернативные точки доставки, включая внутримышечное, пероральное и интраректальное введение. Кроме того, испытывались векторы на основе разных генов, в частности, на основе вакцины оспы канареек и сальмонеллы, а также вакцины в форме нуклеиновых кислот. Обзоры по результатам этих испытаний были опубликованы (76, 91, 92). Серьезных опасений в плане безопасности не возникало. Хотя ответы в виде нейтрализующих антител были зарегистрированы, активность таких антител на первичных CCR5-тропных изолятах ВИЧ была минимальной и преимущественно штаммоспецифической. Также были обнаружены ЦТЛ ответы, зависимые от CD8. В ряде случаев они были длительными, и отмечалась определенная перекрестная реактивность между подтипами (95), хотя воспроизводимость не была удовлетворительной . Данные об эффективности всех этих вакцин на человеческих популяциях пока отсутствуют. Большинство исследователей полагает, что перспективный идеальный кандидат для вакцины пока еще не создан, и будет необходимо провести оценку дополнительных кандидатов, дающих сильный, широкий и длительный ЦТЛ ответ плюс образование нейтрализующих антител.

Существуют многочисленные научные возможности в плане ускорения развития вакцины. Необходимо разработать методы стимуляции иммуногенности специфических ВИЧ пептидов и стимуляции образования антител в ответ на отдельные участки ВИЧ белков, которые в естественных условиях защищены от узнавания иммунной системой. Эти участки обычно являются наиболее консервативными, поэтому узнающие их антитела, вероятно, будут иметь более широкую эффективность в отношении различных подтипов и штаммов ВИЧ. Также требуется лучшее понимание роли адъювантов.

Другим важным инструментом для создания вакцины является быстро развивающаяся область геномики. Лучшее понимание генома человека, а также генома вируса приведет к выявлению генетических факторов, определяющих лиц, дающих иммунологическую реакцию, и лиц с иммунологической резистентностью. Анализ профиля экспрессии генов и исследование сцепления с полиморфными генетическими маркерами человека в ходе испытаний вакцины (а также в связи с инфекцией ВИЧ) будет способствовать выявлению генов, вызывающих устойчивость к инфекции, и сможет помочь определить, какие вакцины будут наилучшими для определенных конкретных групп населения.

Предстоит провести значительную работу и в области перехода от исследований на животных к клиническим испытаниям. Необходимы новые векторы и более эффективные методы производства векторов. Наиболее важным аспектом перехода от исследований на животных к клиническим испытаниям является достижение лучшего понимания ответа иммунной системы на вакцины. В этой связи исключительно ценным оказалось создание оригинальных анализов на антитела и ЦТЛ, однако они являются относительно трудоемкими и сложными. Разрабатываются новые, более эффективные технологии, дающие подробную информацию о специфичности рецепторов Т-лимфоцитов и профилях цитокинов (96). Эти технологии будут важны для выявления и дальнейшей разработки новых кандидатов на вакцину.

Клинические исследования на человеке остаются критическим переходным звеном между лабораторными исследованиями и эффективной вакциной. Крайне важной в этом отношении является информационная сеть клинических испытаний в развитых и развивающихся странах. Также исключительно важным моментом является успешное сотрудничество государственного и частного сектора в создании базы знаний, производства и сети распределения вакцины. Необходимость в этом появится в какой-то момент после того, как эффективная вакцина будет создана. Поиски создания вакцины против ВИЧ оказались медленным и иногда обескураживающим процессом, однако решимость медико-биологического сообщества разрешить эту проблему растет. Хотя решения пока еще нет, чувствуется ощутимый прогресс, кроме того регулярно появляются обнадеживающие результаты. Твердая решимость достичь успеха и продвижение вперед в решении научных основ создания вакцины против СПИДа позволят выполнить эту беспрецедентную задачу.