Определение вирусной нагрузки ВИЧ (продолжение)

Варианты метода Quantiplex ВИЧ-1 РНК
[Содержание]
Существует три поколения анализа Quantiplex. В настоящее время применяется версия 3.0. Как правило, анализ Quantiplex отличается высокой воспроизводимостью результатов (11, 12, 14, 15) и позволяет определять 2-3-кратные изменения содержания ВИЧ-1 РНК (11). Версия 3.0 отличается от предыдущих версий главным образом структурой зонда и составом разбавляющих растворов, которые сводят к минимуму неспецифическую гибридизацию и повышают амплификацию сигнала, снижая тем самым фоновый сигнал и повышая чувствительность. В результате этого версия 3.0 позволяет проводить точное количественное определение вплоть до таких низких концентраций, как 50 копий/мл, и имеет динамический диапазон, составляющий 4 десятичных логарифма (log), т.е. вплоть до 500000 копий/мл. Версия 3.0 также имеет повышенную пропускную способность, поскольку на одном планшете можно анализировать 84 образца. Данные по вирусной нагрузке, получаемые с помощью набора ВИЧ-1 Quantiplex 3.0, нельзя непосредственно сопоставлять с предыдущими вариантами определения bДНК. В среднем, результаты анализа версии 3.0 в 1,75 раза превышают значения, которые были получены с помощью того же анализа в версии 2.0 (17).

Анализ AMPLICOR HIV-1 MONITOR
[Содержание]

Описание метода
[Содержание]
Метод AMPLICOR HIV-1 MONITOR (ОТ-ПЦР, Roche Diagnostics Corporation, Branchburg, NJ) представляет собой единственный утвержденный FDA тест для количественного определения ВИЧ-1 РНК. Он основан на обратной транскрипции (ОТ) ВИЧ-1 РНК (мишени) и амплификации полученной кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (18). Вирусную РНК экстрагируют из плазмы крови гуанидин-изотиоцианатом, в качестве антикоагулянта в кровь добавляют кислый раствор цитрата/глюкозы или ЭДТА; после этого нуклеиновую кислоту из относительно неочищенного лизата осаждают изопропанолом. Обратная транскрипция и амплификация в ПЦР осуществляются в один этап с использованием термостабильного рекомбинантного фермента ДНК полимеразы Thermus thermophilus (rTth pol), обладающей как ОТ, так и ДНК-полимеразной активностью. Сегменты вирусной кДНК подвергаются экспоненциальной амплификации до высокого числа копий (ампликонов) в рамках повторных циклов нагрева и охлаждения в присутствии биотинилированных олигонуклеотидных праймеров, специфичных в отношении консервативного района ВИЧ-1 gag, rTth pol, дезоксинуклеотид-трифосфатов и соответствующих буферных компонентов. Ампликоны подвергаются денатурации, и однотяжевую ДНК связывают с поверхностью лунок планшета для микротитрования, покрытых ВИЧ-специфическими олигонуклеотидными зондами. Добавляют конъюгат авидина с пероксидазой хрена, который связывается с ампликонами, мечеными биотином. Количество связанных ампликонов определяется после добавления колориметрического субстрата, специфичного для пероксидазы хрена.

Тест AMPLICOR HIV-1 MONITOR использует внутренний количественный стандарт с известной концентрацией, которая перед экстракцией добавляется к каждому образцу как для количественного определения ВИЧ-1 РНК в образце, так и для того, чтобы компенсировать действие присутствующих в плазме ингибиторов, которые могут затруднять экстракцию и амплификацию. Количественный стандарт состоит из РНК, транскрибированной in vitro, и идентичной по размеру ампликону-мишени, использующей те же участки связывания затравки ВИЧ-1 gag, что приводит к формированию ампликона, который также иммобилизируется на планшете для микротитрования. Колориметрическое считывание осуществляется за счет системы детекции, связанной с ферментом, которая позволяет отличить ампликон внутреннего стандарта от ампликонов вирусной РНК-мишени.

Варианты метода AMPLICOR HIV-1 MONITOR
[Содержание]
Стандартный анализ AMPLICOR HIV-1 MONITOR версия 1.0 дает возможность количественно определять ВИЧ-1 в интервале от 400 до 750000 копий РНК/мл, для проведения анализа требуется 0,2 мл плазмы. Утвержденный FDA вариант под названием "УльтраСенситив" позволяет определять низкие концентрации РНК. Модификация заключается в увеличении исходного объема образца (0,5 мл плазмы), включении этапа ультрацентрифугирования для концентрации вирусных частиц и уменьшении объема при ресуспендировании (19). Эта модификация процедуры снижает нижний предел количественного определения до 50 копий/мл, однако верхний предел также снижается до 75000 копий/мл. Таким образом, с учетом двух разных способов подготовки образца, общий линейный интервал для анализа AMPLICOR HIV-1 MONITOR составляет 50-750000 копий/мл. Однако, может потребоваться двукратная обработка и определение образца, если исходно выбирается неподходящая процедура. Поэтому целесообразно перед постановкой анализа иметь какую-то информацию о больном (например, наличие антиретровирусной терапии, прежние значения вирусной нагрузки), чтобы принять решение о предпочтительном варианте анализа.

Существует хорошее соответствие между рассчитанными концентрациями РНК в рамках Стандартного анализа и УльтраСенситив в том динамическом диапазоне, который ими перекрывается (19). Результаты, получаемые двумя методами, обычно различаются меньше, чем в два раза, причем метод УльтраСенситив дает слегка заниженные данные о концентрации ВИЧ-1 (в среднем на 22% ниже по сравнению со Стандартной процедурой).

Следующее поколение анализа AMPLICOR HIV-1 MONITOR, версия 1.5, в настоящее время доступна только в США. Версия 1.5 была разработана для использования со всеми субтипами ВИЧ-1, относящимися к группе M. Варианты отличаются только в отношении затравок, условий амплификации и состава буфера для ОТ-ПЦР ( (20, 21). В версии1.0 используется пара затравок (праймеров) SK642 (upstream или смысловой) и SK431 (downstream или антисмысловой) для амплификации последовательности гена gag ВИЧ-1 длиной 142 нуклеотида. Тест-праймеры в версии 1.5 связываются с одним и тем же участком gag. Однако отличие в два нуклеотида по сравнению с праймером SK642 дает upstream (смысловой) праймер SK145, который имеет повышенную гомологию ко всем изолятам ВИЧ-1 группы М. Downstream (антисмысловой) праймер SKCC1B слегка сдвинут в 3' направлении, в более консервативный район гена gag ВИЧ-1 и содержит одно отличие в своей последовательности по сравнению с SK431. Температура отжига является более низкой при использовании версии 1.5, и состав буфера для ПЦР несколько изменен для того, чтобы дополнительно повысить амплификацию в случае различных штаммов ВИЧ. В связи с повышением длины тест-ампликона, размеры РНК, являющейся количественным стандартом, увеличены на 20 нуклеотидов, однако они имеют такую же последовательность для иммобилизации зонда, как и в случае версии 1.0. Все остальные аспекты этого анализа являются такими же, как и для версии 1.0.

Кроме того, вариант анализа 1.5 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR имеет отличие, позволяющее иммобилизировать ампликоны на магнитных сферах, а не на планшете для микротитрования, причем используется автоматический анализатор COBAS AMPLICOR, который позволяет осуществлять большое число анализов.

Преимуществами использования анализа AMPLICOR HIV-1 MONITOR для количественного определения вирусной нагрузки является статус (утвержден FDA), наличие внутренних количественных стандартов и широкое распространение в клинических и научных лабораториях, включая лаборатории Национального института здоровья, работающие по программе Группы клинических испытаний СПИДа (ACTG). Для выполнения анализа требуется один день, причем производительность (число анализируемых образцов) может быть очень высокой. Однако в связи с тем, что последовательности вирусной РНК подвергаются амплификации в ПЦР, существует возможность загрязнения высоко копируемыми ампликонами, что может приводить к ошибочным (в частности, ложно-положительным) результатам. Такие ошибки можно свести к минимуму, строго придерживаясь правил лабораторной работы, включая движение анализируемых проб в лаборатории в одном направлении, отделение друг от друга этапов, на которых осуществляется работа с нуклеиновой кислотой ВИЧ с низким и высоким числом копий, использование положительных и