Главная Новости о СПИДе Ссылки Статьи о СПИДе Интересное о СПИДе

 

 


Лечение СПИДа Профилактика СПИДа


Определение вирусной нагрузки ВИЧ

 

 

 





Введение
[Содержание]

Даже при отсутствии лечения период клинической латентности при инфекции ВИЧ может быть достаточно продолжительным. Несмотря на это, в организме ВИЧ-инфицированного человека высокими темпами идут процессы образования новых вирусных частиц и разрушения CD4+ Т-лимфоцитов, что приводит к возникновению СПИДа (1, 2, 3). Абсолютный уровень виремии плазмы в стационарном состоянии ("вирусная нагрузка ") является достоверным предсказательным фактором скорости прогрессии заболевания и в сочетании с содержанием CD4+ T-лимфоцитов имеет огромное прогностическое значение (4-6) (Рис. 1). Определение вирусной нагрузки в плазме крови широко используется для мониторинга изменений виремии в ходе антиретровирусной лекарственной терапии, причем именно этот показатель является наиболее ценным маркером эффективности антиретровирусных препаратов, более ценным, чем изменение содержания CD4 T-лимфоцитов (4, 5, 7-9). В связи с этим разработаны многочисленные подходы и методы анализа для количественного определения ВИЧ-1 РНК. В настоящей публикации мы описываем три наиболее широко применяемых коммерческих метода определения вирусной нагрузки. Рассматриваются характеристики методов, которые делают их предпочтительными для применения в той или иной клинической ситуации (Таблица 1).

Анализ Quantiplex (bДНК)
[Содержание]

Описание метода
Метод Quantiplex HIV-1 RNA (Chiron Diagnostics, Norwood, MA) представляет собой метод сэндвича с использованием разветвленной ДНК (bДНК), который позволяет количественно определять содержание ВИЧ-1 РНК в плазме крови за счет амплификации сигнала, а не нуклеиновой кислоты, являющейся мишенью (10-12). Метод, основанный на bДНК, не требует очистки вирусной РНК или ее амплификации с помощью ПЦР. Вирусные частицы концентрируют центрифугированием и далее разрушают детергентом и протеиназой К, что приводит к высвобождению вирусной РНК. Полученный лизат далее инкубируют с двумя наборами олигонуклеотидов. Первый набор олигонуклеотидов необходим для иммобилизации вирусной РНК за счет гибридизации с консервативными районами гена pol ВИЧ-1 и с олигонуклеотидами, которые связаны с лунками планшетов для микротитрования. Второй набор олигонуклеотидов обеспечивает амплификацию сигнала. Этот набор состоит из четырех компонентов: (а) олигонуклеотиды, обладающие гомологией с РНК мишени и с "предамплификационными" олигонуклеотидами; (б) предамплификационные олигонуклеотиды; (в) амплификационные олигонуклеотиды; и (г) олигонуклеотидные зонды, связанные с щелочной фосфатазой. Каждый из этих компонентов связывается в результате гибридизации с последующим в нескольких участках. Таким способом сигнал подвергается амплификации без копирования РНК-мишени. Принципиальная схема метода приведена на Рис 2. Детекция проводится с помощью метода хемилюминесценции с субстратом, специфическим для щелочной фосфатазы. Количество испускаемого света прямо пропорционально количеству связавшейся нуклеиновой кислоты. Абсолютное содержание ВИЧ-1 РНК определяется с помощью стандартной кривой (используется внешний стандарт), которая строится на основании данных, полученных на том же планшете.

Важным преимуществом этой стратегии амплификации сигнала является возможность избежать ошибок количественного определения последовательности нуклеиновой кислоты, связанных с экстракцией и амплификацией. В сравнительных исследованиях с методами, основанными на амплификации мишени, метод Quantiplex ВИЧ-1 РНК часто дает лучшую воспроизводимость (13-16), особенно в области более низких значений в динамическом диапазоне. Кроме того, присутствующие в плазме вещества и антикоагулянты, такие как гепарин, которые могут подавлять реакцию ОТ-ПЦР (см. ниже), не оказывают отрицательного влияния на определение по методу bДНК. Олигонуклеотидные зонды, использующиеся в анализе по методу bДНК, одинаково хорошо связываются с субтипами А-F группы М ВИЧ-1 (11), что позволяет проводить измерения вирусной нагрузки разных штаммов ВИЧ-1. Недостатки определения с помощью метода bДНК включают отсутствие внутреннего количественного стандарта для каждого образца и потребность в относительно больших объемах образца (по крайней мере, 1 мл плазмы крови), что может создавать проблемы при ограниченном объеме образца, например, при анализе материала от маленьких детей.

далее

 

 

@ 2007 СТОП_СПИД!

 


Hosted by uCoz